Департамент здравоохранения Воронежской области
БУЗ ВО «Воронежская областная клиническая больница №1»
Исследование крови на стерильность
на современном этапе
Информационно-методическое письмо для врачей-бактериологов
Составители: главный внештатный специалист по микробиологической диагностике
департамента здравоохранения Воронежской области, заведующий бактериологической лабораторией
БУЗ ВО ВОКБ №1 Е.В. Бондаренко
Врач-бактериолог БУЗ ВО ВОКБ№1 Т.М. Лапа
Воронеж
2015
Кровь - один из наиболее распространенных образцов биоматериала, исследуемых в бактериологической лаборатории. Исследование крови на стерильность является важнейшим методом лабораторного исследования у пациентов с определенными показаниями.
Основные показания для посева крови:
- Лихорадка (более 38°C)
- Гипотермия (менее 36°C)
- Лейкоцитоз
- Гранулоцитопения
Бактерии проникают в кровь экзогенным (например, при травме) и эндогенным (из очага инфекции) путями.
Бактериемия: Наличие бактерий в крови, подтвержденное результатами посева
- Транзиторная бактериемия, когда происходит кратковременный выброс в кровь микроорганизмов под действием таких факторов, как физическая нагрузка, перегревание, переохлаждение. Подобные явления протекают обычно бессимптомно.
- Интермиттирующая бактериемия, когда существует локальный очаг инфекции, например пневмония или внутрибрюшной абсцесс.
- Продолжающаяся бактериемия проявляется внутрисосудистой
инфекцией, например, инфекционным эндокардитом или септическим тромбофлебитом.
Сепсис – это патологический процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного (системного) воспаления на инфекцию различной природы (бактериальную, вирусную, грибковую).
В последнее десятилетие в мире отмечается учащение случаев бактериемии и фунгемии. Это связано с развитием инвазивных медицинских вмешательств, старением населения, увеличением количества трансплантаций органов и костного мозга, увеличением количества более вирулентных и трудно поддающихся лечению микроорганизмов, более агрессивной внутрибольничной инфекцией.
Факторы риска, способствующие проникновению бактерий в кровяное русло и развитию бактериемии:
- внутривенные катетеры
- катетер мочевого пузыря
- любые инвазивные процедуры
- операционные вмешательства
- нейтропения
- терапия антибиотиками (эмпирическая), кортикостероидами, цитотоксическая
Гемокультивирование является в настоящее время «золотым стандартом» в диагностике септицемии
Принципы микробиологической диагностики
Точный диагноз устанавливается только при обнаружении возбудителей в крови пациентов. Важное условие - своевременный забор пробы. Для проведения анализа используют кровь непосредственно из венозного сосуда. Сбор пробы из постоянного внутривенного или внутриартериального катетеров допускается только в случаях подозрения на наличие катетер-ассоциированной инфекции или отсутствия возможности ее получения венопункцией.
- Лихорадка и озноб начинается примерно через час после попадания микроорганизмов в кровоток
- Чаще всего кровь забирается как можно скорее после приступа лихорадки или озноба при подозрении на инфекцию
- Забор крови должен осуществляться по возможности до назначения антимикробной терапии.
Объем крови – один из наиболее значимых факторов в повышении чувствительности гемокультивирования. Считается, что риск случайной контаминации 1 отдельно взятой пробы крови составляет 3% (0,03).
Тогда вероятность случайной контаминации одновременно 2 проб составляет: 0,03*0,03=0,0009= 0,09%. Поэтому более информативно исследование 2 и более проб каждая объемом не менее 10мл.
Рекомендуемое число отбираемых проб крови в зависимости от предполагаемого заболевания по МУ 4.2.2039-05Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории:
1) Острый сепсис, менингит, менингококоцемия, остеомиелит, артрит, острая пневмония, пиелонефрит 2 пробы из двух сосудов или двух участков кровеносного сосуда перед началом антибактериальной терапии
2) Лихорадка неясного генеза 4 сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем через 24-36 ч. еще 2 пробы
3) При подозрениях на наличие эндокардита и вялотекущего сепсиса: при обострении 2 пробы из двух сосудов в течение первых 1 - 2 ч подъема температуры тела (не на пике температуры!) до начала терапии; при подостром и вялотекущем течении сначала 3 пробы с интервалом 15 мин. и более. Если все пробы отрицательны, на вторые сутки после посева собирают еще 3
4) у пациентов с эндокардитами, получающими антибиотики, собирают по 2 отдельные пробы в течение трех дней
5) У больных, в комплекс терапии которых включены антибиотики, собирают 6 проб в течение 48 ч; пробы необходимо собирать непосредственно перед введением следующей дозы препарата
6) при лихорадке неясного генеза сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов, затем через 24-36 часов еще 2 пробы
Минимальный набор сред для посева крови согласно положениям Приказа 535:
“Двойная среда” - скошенный во флаконе 1,7-2% питательный агар (150 мл) и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара.
“Среда для контроля стерильности” - стандартная тиогликолевая среда к которой добавляют 15-20 г дрожжевого экстракта и агар 4,25-5 г на 1 литр к среде добавляют 0,001 г резазурина в качестве индикатора анаэробиоза.
Необходимое оснащение для взятия крови:
- Флаконы с питательными средами.
- 70о этиловый спирт;
- 2% или 5% настойка йода
- венозный жгут
- резиновые (латексные, виниловые) перчатки
- спиртовка (только при использовании флаконов со средами, изготовленными в лаборатории)
Техника получения пробы крови. Сбор проб крови для посева производят 2 человека у постели больного или в процедурной.
- участок кожи над выбранным для пункции сосудом продезинфицировать: обработать кожу тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 1 - 2%-м раствором йода или другим дезинфектантом, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 с; подождать, пока высохнет обработанный участок. Не допускается пальпировать сосуд после обработки кожи перед введением иглы;
- при работе с флаконами с двойной средой: стерильным шприцем собрать у взрослых 10 мл крови, у детей - 5 мл; над пламенем спиртовки открыть флакон; внести кровь во флакон из шприца, предварительно сняв иглу; обжечь горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки, закрыть флакон пробкой; осторожно, чтобы не замочить пробку флакона, перемешать его содержимое круговыми движениями.
Отобранный материал быстро доставляется в лабораторию. Образцы крови замораживать нельзя! Микроскопию мазков крови проводят при подозрении на паразитарные инфекции (малярия, трипаносомоз), при бактериальных инфекциях это нецелесообразно, так как единственная бактерия, обнаруживаемая в мазках,- Borreliarecurrentis. Посевы инкубируют при 37°С с ежедневным просмотром в течении 8 дней. При отсутствии видимого роста со всех сред кроме «двойной среды» среды для контроля стерильности делают высевы на кровяной агар и мазки на 3,5,8 дни. При отсутствия роста дают отрицательный ответ на 9-10 день. При наличии помутнения, образования хлопьев, крошек, необходимо произвести высев из флакона независимо от дня исследования.
Визуальные признаки роста гемокультур при посевах крови
Макроскопические |
Возможные микроорганизмы |
Гемолиз |
Стрептококки, стафилококки, Listeria spp., клостридии, Bacillus spp. |
Помутнение |
Аэробные грам(-) палочки, стафилококки, Bacteroides spp. |
Газообразование |
Аэробные грам(-) палочки, анаэробы |
Образование пленки |
Pseudomonas spp., Bacillus spp., дрожжевые клетки |
Образование хлопьев |
S.aureus |
Видимые колонии («дымчатые») |
Стафилококки, стрептококки |
Причины отрицательных результатов:
- Локальная инфекция (защитные силы организма удерживают инфекцию в одном месте)
- Неактуальное время взятия материала (вероятность упустить интермиттирующую бактериемию )
- Слишком маленький объем полученного материала
- Прием антибиотиков пациентом
Идентификация выделенных бактерий при бактериемиях:
- Значимы и часто встречаются - S.aureus, S.pneumoniae, E.coli и др. энтеробактерии, P.aeruginosa, C.albicans
- Значимы - S.pyogenes, S.agalactiae, L.monocytogenes, N.meningitidis, N.gonorrhoeae, H.influenzae, B.fragilis группа, Candida spp, Cryptococcus neoformans
- Контаминанты или нет? (зависит от конкретных случаев)– КОС, зеленящие стрептококки, Propionibacterium acnes, Acinetobacter calcoaceticus, Clostridium spp., Corynebacterium spp., Bacillus spp
Дополнительные критерии в пользу клинической значимости изолята:
- Быстрое выделение культуры – в течение первых 48 часов
- Выделение монокультуры
- Выделение одного и того же вида микроорганизма в разных пробах
- Выделение одного и того же вида микроорганизма из крови и других локусов
Помимо ручных методов существуют методы автоматизированного культивирования крови, которые являются более современными, более чувствительными. Самая известная серия бактериологических анализаторов для посева крови на стерильность,- BDBACTEC.
Прибор Bactec предназначен для ускоренного обнаружения бактерий и грибов в клинических образцах крови. Образцы крови отбираются у пациентов и вносятся напрямую в оригинальные флаконы с питательной средой, после чего – по возможности незамедлительно – помещаются в рабочие станции приборов серии BD Bactec™ 9000. Наличие микроорганизмов в крови устанавливается с помощью высокочувствительной флуоресцентной технологии, основанной на индикации СО2, выделяемого в питательную среду растущими и интенсивно делящимися микроорганизмами. С помощью системы BD BACTEC 90% положительных результатов выявляются в первые 24 часа инкубации, что позволяет своевременно начать эмпирическую антибактериальную терапию либо внести изменения в действующую схему лекарственной терапии. Своевременная бактериологическая диагностика бактериемии значительно сокращает частоту возникновения септического шока и увеличивает выживаемость больных.
Флаконы для гемокультивирования выпускаются нескольких видов. Наиболее часто используются следующие:
- Флаконы со средой для культивирования аэробов
- Флаконы со средой для культивирования анаэробов
- содержат частицы латекса, адсорбирующие антибиотики из крови, а также способствующие лизису клеток крови и освобеждению внутриклеточных бактерий.
- Флаконы со средой для культивирования детской крови
- предназначены для исследования малого объема крови до 3 мл, также содержат частицы латекса
- Флаконы с селективной средой для выявления дрожжей и грибов
- содержат хлорамфеникол и тобрамицин для подавления роста сопутствующих бактерий, лизирующие вещества, способствующие освобождать из лейкоцитов фагоцитированные грибы.
Используется вакуумное взятие крови с использованием системы для забора крови игла-бабочка. Под действием вакуума кровь втягивается через иглу BD VacutainerTM напрямую из вены в пробирки BD VacutainerTM и флаконы BD BactecTM и сразу же смешивается с питательной средой.
Традиционно отбор проб крови осуществляется одномоментно в аэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Aerobic/F) и в анаэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Anaerobic/F) флаконы. Альтернативный набор складывается из: а) аэробного флакона и дополнительного аэробного; б) анаэробного и/или Mycosis IC/F, и/или Myco F/Lytic флаконов (оба типа флаконов – для культивирования гемокультур грибов).
Оптимальный объем крови для гемокультивирования
- Дети:
- Новорожденные 1-2 мл крови/флакон (допустимый для посева объём крови – 0,5-5 мл)
- Дети 2-5 мл/флакон
- Подростки 10-20 мл/флакон
- Взрослые:
Одномоментно 20 -30 мл (по 10 мл во флакон) крови 2 или 3 раза в течение 24 ч
ШАГ 1 |
|
ШАГ 2 |
|
ШАГ 3 |
|
|
|
ШАГ 4 |
|
При правильном заборе крови контаминация составляет не более 2-3 % всех гемокультур. Использование наборов для забора крови BD VacutainerTM существенно снижает степень контаминированности культур.
При наличии роста микроорганизма во флаконе анализатор оповещает персонал лаборатории с помощью световой индикации на передней панели прибора, а также с помощью звуковой индикации. Таким образом, нет необходимости делать высевы из всех флаконов, высев делается целенаправленно из положительного флакона.
Объем исследований и микропейзаж при гемокультивировании в бактериологических лабораториях ЛПУ Воронежской области.
Общее количество проб крови для исследования на стерильность по Воронежской области составило 12515. В 2013г это число было гораздо меньше: 8406. Доля этих анализов по лечебно-профилактическим учреждениям показана в таблице:
Районные ЛПУ |
15,8% |
Областные ЛПУ |
59,8% |
Городские ЛПУ |
24,4% |
Общее количество положительных высевов из образцов крови по области 1245, что составило 9,95% , в 2013г 808, что составило 9,6%.
ЛПУ |
Общее количество |
Кол-во положительных анализов |
Процент высеваемости |
Районные ЛПУ |
1987 |
160 |
8 |
Областные ЛПУ |
7436 |
769 |
10,3 |
Городские ЛПУ |
3092 |
316 |
10,2 |
Микропейзаж выделенных культур:
Наиболее часто из крови выделялись следующие культуры: S. аureus- 165, коагулазоотрицательные стафилококки- 639 (основная масса- S. epidermidis- 478), Enterococcus faecalis- 74, Pseudomonas sp- 59, Klebsiella- 54, E. coli-31, Enterococcus faecium 36. Среди грибов рода Candida чаще всего выделялись C. albicans и C. glabrata.
В небольшом количестве выделялись: Enterobacter-18, Ps. aeruginosa 20, Acinetobacter 17, Streptococcus spp 20.
В количестве от 2 до 5 выделялись такие культуры, как Str.viridans, Str. β-haemolyticus, Str pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Candida tropicalis, Candida krusei.
Все бактериологические лаборатории в Воронежской области, за исключением двух, исследуют кровь на стерильность ручными методами. Бактериологические анализаторы «Бактек» имеются в бактериологических лабораториях Воронежской областной клинической больницы №1 и в лаборатории Перинатального центра 1к. В результате анализа микробиологического мониторинга за 2011-2014гг в этих лабораториях отмечается увеличение количества высеваемости культур микроорганизмов. До использования аппаратной технологии высеваемость микроорганизмов из крови в составляла в 2010-2012гг от 6 до 10%, при исследовании с помощью «BD Bactec 9050» в 2013г- 24,7%, в 2014г-26,9% у взрослых пациентов и у новорожденных в 2013гг 17,5%, в 2014г-20,3%.
Литература
1. «Руководство по медицинской микробиологии» под редакцией А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, Москва, 2013г
2. «Методы клинических лабораторных исследований». Справочное пособие под редакцией В.В. Меньшикова. Том 3 Клиническая микробиология. М, 2009.
3. «Лаборатория» журнал для врачей №5 2014г
4. «Клиническая микробиология» П.Р. Мари, И.Р. Шей, краткое руководство, пер с англ., Москва, 2006г
5. Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия
2013, том 15 (4).