Воронежская областная
клиническая больница №1

                Департамент  здравоохранения  Воронежской  области

 

           БУЗ  ВО  «Воронежская  областная  клиническая  больница  №1»

 

Исследование крови на стерильность

на современном этапе

Информационно-методическое  письмо  для  врачей-бактериологов

 

   Составители: главный внештатный специалист  по микробиологической диагностике

департамента здравоохранения Воронежской области, заведующий бактериологической лабораторией

БУЗ ВО ВОКБ №1   Е.В. Бондаренко

Врач-бактериолог БУЗ ВО ВОКБ№1 Т.М. Лапа

 

Воронеж

2015

 

Кровь - один из наиболее распространенных образцов биоматериала, исследуемых в бактериологической лаборатории. Исследование крови на стерильность является важнейшим методом лабораторного исследования у пациентов с определенными показаниями.

Основные показания для посева крови:

• Лихорадка (более 38°C)
• Гипотермия (менее 36°C)
• Лейкоцитоз
• Гранулоцитопения

Бактерии проникают в кровь экзогенным (например, при травме) и эндогенным (из очага инфекции) путями.

Бактериемия: Наличие бактерий в крови, подтвержденное результатами посева

 

• Транзиторная бактериемия, когда происходит кратковременный выброс в кровь микроорганизмов под действием таких факторов, как физическая нагрузка, перегревание, переохлаждение. Подобные явления протекают обычно бессимптомно.
• Интермиттирующая бактериемия, когда существует локальный очаг инфекции, например пневмония или внутрибрюшной абсцесс.
• Продолжающаяся бактериемия проявляется внутрисосудистой

инфекцией, например, инфекционным эндокардитом или септическим тромбофлебитом.

Сепсис – это патологический процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного (системного) воспаления на инфекцию различной природы (бактериальную, вирусную, грибковую).

В последнее десятилетие в мире отмечается учащение случаев бактериемии и фунгемии. Это связано с развитием инвазивных медицинских вмешательств, старением населения, увеличением количества трансплантаций органов и костного мозга, увеличением количества более вирулентных и трудно поддающихся лечению микроорганизмов, более агрессивной внутрибольничной инфекцией.

Факторы риска, способствующие проникновению бактерий в кровяное русло и развитию бактериемии:

• внутривенные катетеры
• катетер мочевого пузыря
• любые инвазивные процедуры
• операционные вмешательства
• нейтропения
• терапия антибиотиками (эмпирическая), кортикостероидами, цитотоксическая                      

Гемокультивирование является в настоящее время «золотым стандартом» в диагностике септицемии

Принципы микробиологической диагностики

Точный диагноз устанавливается только при обнаружении возбудителей в крови пациентов. Важное условие - своевременный забор пробы. Для проведения анализа используют кровь непосредственно из венозного сосуда. Сбор пробы из постоянного внутривенного или внутриартериального катетеров допускается только в случаях подозрения на наличие катетер-ассоциированной инфекции или отсутствия возможности ее получения венопункцией.

• Лихорадка и озноб начинается примерно через час после попадания микроорганизмов в кровоток
• Чаще всего кровь забирается как можно скорее после приступа лихорадки или озноба при подозрении на инфекцию
• Забор крови должен осуществляться по возможности до назначения антимикробной терапии.

Объем крови – один из наиболее значимых факторов в повышении чувствительности гемокультивирования. Считается, что риск случайной контаминации 1 отдельно взятой пробы крови составляет 3% (0,03).

Тогда вероятность случайной контаминации одновременно 2 проб составляет: 0,03*0,03=0,0009= 0,09%. Поэтому более информативно исследование 2 и более проб каждая объемом не менее 10мл.

Рекомендуемое число отбираемых проб крови в зависимости от предполагаемого заболевания по МУ 4.2.2039-05Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории:

 1) Острый сепсис, менингит, менингококоцемия, остеомиелит, артрит, острая пневмония,  пиелонефрит 2 пробы из двух сосудов или двух участков кровеносного сосуда перед началом антибактериальной терапии

2) Лихорадка неясного генеза 4 сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем через 24-36 ч. еще 2 пробы

3) При подозрениях на наличие эндокардита и вялотекущего сепсиса: при обострении 2 пробы из двух сосудов в течение первых 1 - 2 ч подъема температуры тела (не на пике температуры!)  до начала терапии;  при подостром и вялотекущем течении сначала 3 пробы с интервалом 15 мин. и более. Если все пробы отрицательны, на вторые сутки после посева собирают еще 3

4) у пациентов с эндокардитами, получающими антибиотики, собирают по 2 отдельные пробы в течение трех дней

5) У больных, в комплекс терапии которых включены антибиотики, собирают 6 проб в течение 48 ч; пробы необходимо собирать непосредственно перед введением следующей дозы препарата

6) при лихорадке неясного генеза сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов, затем через 24-36 часов еще 2 пробы

Минимальный набор сред для посева крови согласно положениям Приказа 535:

“Двойная среда” - скошенный во флаконе 1,7-2% питательный агар (150 мл) и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара.

“Среда для контроля стерильности” - стандартная тиогликолевая среда к которой  добавляют 15-20 г дрожжевого экстракта и агар 4,25-5 г на 1 литр к среде добавляют  0,001 г резазурина в качестве индикатора анаэробиоза.

 Необходимое оснащение для взятия крови:

• Флаконы с питательными средами.
• 70о  этиловый спирт;
• 2% или 5% настойка йода
• венозный жгут
• резиновые (латексные, виниловые) перчатки
• спиртовка (только при использовании флаконов со средами, изготовленными в лаборатории)

 Техника получения пробы крови. Сбор проб крови для посева производят 2 человека у постели больного или в процедурной.

- участок кожи над выбранным для пункции сосудом продезинфицировать: обработать кожу тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 1 - 2%-м раствором йода или другим дезинфектантом, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 с; подождать, пока высохнет обработанный участок. Не допускается пальпировать сосуд после обработки кожи перед введением иглы;

- при работе с флаконами с двойной средой: стерильным шприцем собрать у взрослых 10 мл крови, у детей - 5 мл; над пламенем спиртовки открыть флакон; внести кровь во флакон из шприца, предварительно сняв иглу; обжечь горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки, закрыть флакон пробкой; осторожно, чтобы не замочить пробку флакона, перемешать его содержимое круговыми движениями.

Отобранный материал быстро доставляется в лабораторию.  Образцы крови замораживать нельзя! Микроскопию мазков крови проводят при подозрении на паразитарные инфекции (малярия, трипаносомоз), при бактериальных инфекциях это нецелесообразно, так как единственная бактерия, обнаруживаемая в мазках,-  Borreliarecurrentis. Посевы инкубируют при 37°С с ежедневным просмотром в течении 8 дней. При отсутствии видимого роста со всех сред кроме «двойной среды» среды для контроля стерильности делают высевы на кровяной агар и мазки на 3,5,8 дни. При отсутствия роста дают отрицательный ответ на 9-10 день. При наличии помутнения, образования хлопьев, крошек, необходимо произвести высев из флакона независимо от дня исследования.

 

Визуальные признаки роста гемокультур при посевах крови

 

Макроскопические  изменения среды	Возможные микроорганизмы
Гемолиз	Стрептококки, стафилококки,     Listeria spp., клостридии, Bacillus spp.
Помутнение	Аэробные грам(-) палочки, стафилококки, Bacteroides spp.
Газообразование	Аэробные грам(-) палочки, анаэробы
Образование пленки	Pseudomonas spp., Bacillus spp.,     дрожжевые клетки
Образование хлопьев	S.aureus
Видимые колонии («дымчатые»)	Стафилококки, стрептококки

 

Причины отрицательных результатов:

- Локальная инфекция (защитные силы организма удерживают инфекцию в одном месте)

- Неактуальное время взятия материала (вероятность упустить интермиттирующую бактериемию )

     - Слишком маленький объем полученного материала

- Прием антибиотиков пациентом

 Идентификация выделенных бактерий при бактериемиях:

• Значимы и часто встречаются - S.aureus, S.pneumoniae, E.coli и др. энтеробактерии, P.aeruginosa, C.albicans
• Значимы -  S.pyogenes, S.agalactiae, L.monocytogenes, N.meningitidis, N.gonorrhoeae, H.influenzae, B.fragilis группа, Candida spp, Cryptococcus neoformans
• Контаминанты или нет? (зависит от конкретных случаев)– КОС, зеленящие стрептококки, Propionibacterium acnes, Acinetobacter  calcoaceticus, Clostridium spp., Corynebacterium spp., Bacillus spp

Дополнительные критерии в пользу клинической значимости изолята:

- Быстрое выделение культуры – в течение первых 48 часов

- Выделение монокультуры

- Выделение одного и того же вида микроорганизма в разных пробах

- Выделение одного и того же вида микроорганизма из крови и других локусов

Помимо ручных методов существуют методы автоматизированного культивирования крови, которые являются более современными, более чувствительными. Самая известная  серия бактериологических анализаторов для посева крови на стерильность,- BDBACTEC.

Прибор Bactec предназначен для ускоренного обнаружения бактерий и грибов в клинических образцах крови. Образцы крови отбираются у пациентов и вносятся напрямую в оригинальные флаконы с питательной средой, после чего – по возможности незамедлительно – помещаются в рабочие станции приборов серии BD Bactec™ 9000. Наличие микроорганизмов в крови устанавливается с помощью высокочувствительной флуоресцентной технологии, основанной на индикации СО2, выделяемого в питательную среду растущими и интенсивно делящимися микроорганизмами. С помощью системы BD BACTEC 90% положительных результатов выявляются в первые 24 часа инкубации, что позволяет своевременно начать эмпирическую антибактериальную терапию либо внести изменения в действующую схему лекарственной терапии. Своевременная бактериологическая диагностика бактериемии значительно сокращает частоту возникновения септического шока и увеличивает выживаемость больных.

Флаконы для гемокультивирования выпускаются нескольких видов. Наиболее часто используются следующие:

• Флаконы со средой для культивирования аэробов
• Флаконы со средой для культивирования анаэробов

- содержат частицы латекса, адсорбирующие антибиотики из крови, а также способствующие лизису клеток крови и освобеждению внутриклеточных бактерий.

• Флаконы со средой для культивирования детской крови

- предназначены для исследования малого объема крови до 3 мл, также содержат частицы латекса

• Флаконы с селективной средой для выявления дрожжей и грибов

- содержат хлорамфеникол и тобрамицин для подавления роста сопутствующих бактерий, лизирующие вещества, способствующие освобождать из лейкоцитов фагоцитированные грибы.

Используется вакуумное взятие крови с использованием системы для забора крови  игла-бабочка. Под действием вакуума кровь втягивается через иглу  BD VacutainerTM  напрямую из вены в пробирки BD VacutainerTM и флаконы BD BactecTM и сразу же смешивается с питательной средой.

Традиционно отбор проб крови осуществляется одномоментно в аэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Aerobic/F) и в анаэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Anaerobic/F) флаконы. Альтернативный набор складывается из: а) аэробного флакона и дополнительного аэробного; б) анаэробного и/или Mycosis IC/F, и/или Myco F/Lytic флаконов (оба типа флаконов – для культивирования гемокультур грибов).

Оптимальный объем крови для гемокультивирования

• Дети:
• Новорожденные         1-2 мл крови/флакон (допустимый для посева объём крови – 0,5-5 мл)
• Дети                                           2-5 мл/флакон
• Подростки                               10-20 мл/флакон            
• Взрослые:

         Одномоментно 20 -30 мл (по 10 мл во флакон) крови 2 или 3 раза в течение 24 ч

 

ШАГ 1	Продезинфицируйте место венепункции 70%-ным раствором этилового спирта. Круговыми движениями от центра к периферии продезинфицируйте место венепункции 1-10%-ным раствором йода или хлоргексидином Дождитесь полного высыхания антисептика
ШАГ 2	Промаркируйте подготовленные к посеву флаконы того или иного типа (с соответствующей задачам исследования питательной средой), указав на этикетке каждого флакона Ф.И.О. пациента и/или № истории болезни, время отбора пробы крови, № и/или название отделения Удалите пластиковый колпачок и протрите резиновую пробку 70%-ным раствором этилового спирта
ШАГ 3	Используйте  BD Vacutainer®  (367282 / 367284) – набор для отбора проб крови (игла -“бабочка” 21G / 23 /G, зелёная с защитной защелкой; 18-тисантиметровый катетер, Луер-адаптер с клапаном для отбора проб крови, 50 шт/упак.) с  адаптером для флаконов (364815; 250 шт/упак.) Пропунктируйте вену Вставьте флакон в держатель Держите флакон строго вертикально
	В первую очередь засевайте аэробный флакон Под действием вакуума кровь начнет набираться во флакон самостоятельно. Наполните флакон соответствующим количеством крови (в “детские” флаконы – 1-3 мл, [для новорожденных – 0,5-2 мл], во “взрослые” флаконы – 7-10 мл) Извлеките флакон из держателя Вставьте в держатель следующий флакон
ШАГ 4	Приложите сухую стерильную салфетку к месту венепункции Извлеките иглу из вены Транспортируйте флаконы в лабораторию как можно скорее

 

При правильном заборе крови контаминация составляет не более 2-3 % всех гемокультур. Использование наборов для забора крови BD VacutainerTM существенно снижает степень контаминированности культур.

При наличии роста микроорганизма во флаконе анализатор оповещает персонал лаборатории с помощью световой индикации на передней панели прибора, а также с помощью звуковой индикации. Таким образом, нет необходимости делать высевы из всех флаконов, высев делается целенаправленно из положительного флакона.

 

Объем исследований и микропейзаж при гемокультивировании в бактериологических лабораториях ЛПУ Воронежской области.

 Общее количество проб крови для исследования на стерильность по Воронежской области составило 12515. В 2013г это число было гораздо меньше: 8406. Доля этих анализов по лечебно-профилактическим учреждениям показана в таблице:

Районные ЛПУ	15,8%
Областные ЛПУ	59,8%
Городские ЛПУ	24,4%

 

Общее количество положительных высевов из образцов крови по области 1245, что составило 9,95% , в 2013г 808, что составило 9,6%.

 

ЛПУ	Общее количество	Кол-во положительных анализов	Процент высеваемости
Районные ЛПУ	1987	160	8
Областные ЛПУ	7436	769	10,3
Городские ЛПУ	3092	316	10,2

 

Микропейзаж выделенных культур:

Наиболее часто из крови выделялись следующие культуры: S. аureus- 165, коагулазоотрицательные стафилококки- 639  (основная масса- S. epidermidis- 478), Enterococcus faecalis- 74, Pseudomonas sp- 59, Klebsiella- 54, E. coli-31, Enterococcus faecium 36. Среди грибов рода Candida чаще всего выделялись C. albicans и C. glabrata.

В небольшом количестве выделялись:  Enterobacter-18, Ps. aeruginosa 20, Acinetobacter 17, Streptococcus spp 20.

В количестве от 2 до 5 выделялись такие культуры, как Str.viridans, Str.   β-haemolyticus, Str pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Candida tropicalis, Candida  krusei.

Все бактериологические лаборатории в Воронежской области, за исключением двух, исследуют кровь на стерильность ручными методами. Бактериологические анализаторы «Бактек» имеются в бактериологических лабораториях Воронежской областной клинической больницы №1 и в лаборатории Перинатального центра 1к. В результате анализа микробиологического мониторинга за 2011-2014гг в этих лабораториях отмечается  увеличение количества высеваемости культур микроорганизмов. До использования аппаратной технологии высеваемость микроорганизмов из крови в составляла в 2010-2012гг от 6 до 10%, при исследовании с помощью «BD Bactec 9050» в 2013г- 24,7%, в 2014г-26,9% у взрослых пациентов и у новорожденных в 2013гг 17,5%, в 2014г-20,3%.

Литература

1. «Руководство по медицинской микробиологии» под редакцией А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, Москва, 2013г

2. «Методы клинических лабораторных исследований». Справочное пособие под редакцией В.В. Меньшикова. Том 3 Клиническая микробиология. М, 2009.

3. «Лаборатория» журнал для врачей №5 2014г

4. «Клиническая микробиология» П.Р. Мари, И.Р. Шей,  краткое руководство, пер с англ., Москва, 2006г

5. Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия
2013, том 15 (4).