+7 (473) 207-24-00

Департамент здравоохранения Воронежской области

БУЗ ВО «Воронежская областная клиническая больница № 1»

 Выпотные жидкости: получение и обработка материала для цитологического исследования

Информационно-методическое письмо для лаборантов и врачей клинической лабораторной диагностики, врачей-клиницистов

Составитель:

Главный внештатный цитолог

департамента здравоохранения Воронежской области, заведующая цитологической лабораторией БУЗ ВО ВОКБ № 1

Е. Е.  Шевелина 

Воронеж  2015

 

Различные заболевания способны привести к нарушению фильтрации и реабсорбции жидкости, в результате чего жидкость может накапливаться в серозных полостях (плевральной, брюшной, перикардиальной), при различных патологических процессах в суставах (синовиальная жидкость). Лабораторное исследование выпотных жидкостей может оказаться решающим при постановке диагноза, может использоваться в экспресс-диагностике или предоставить прогностические данные об исходе заболевания.

Исследование выпотной жидкости включает следующие этапы:

  • макроскопический анализ;
  • биохимический анализ;
  • бактериологический анализ;
  • подсчет клеток и их дифференциальный анализ;
  • цитологическое исследование;
  • иммуноцитохимическое исследование.

Задачами цитологического исследования выпота являются:

  • определение характера патологического процесса (неопухолевый или опухолевый);
  • при неопухолевом процессе идентификация клеточного состава (клетки мезотелия, лимфоциты, эозинофильные, нейтрофильные лейкоциты, лимфоциты, плазматические клетки и др.) с количественной характеристикой найденных клеток: «покрывают все поля зрения», «в большом количестве», «в небольшом количестве», «единичные».
  • в случае опухолевого поражения определение первичного или метастатического процесса;
  • определение, по возможности, первичного очага и/или гистологической формы опухоли.

 Цитологическое исследование выпотных жидкостей особенно актуально при злокачественном заболевании без выявленного первичного очага и при отсутствии возможности или трудностях с получением биопсии для гистологического и ИГХ исследования.

Получение материала проводится посредством аспирационной пункции, при эндоскопическом исследовании (торакоскопии, лапароскопии), при «лечебном» и «диагностическом» перикардиоцентезе. Эвакуированный выпот помещают  в чистую сухую посуду. В лабораторию для цитологического исследования должно быть доставлено максимальное количество жидкости (при возможности вся полученная жидкость). В случае если жидкости эвакуировано очень много, можно принести ее часть (около литра), обязательно последнюю порцию, как наиболее богатую клеточными элементами. Серозная жидкость при хранении может свернуться, поэтому ее желательно срочно доставить в лабораторию, обработать и приготовить препараты. Если такой возможности нет, в жидкость необходимо добавить антикоагулянт или стабилизатор: для цитологического исследования это гепарин из расчета  10 МЕ на 1 мл жидкости.

Исследование клеточного состава свернувшейся жидкости недопустимо, поскольку клетки при свертывании поглощаются сгустком и в осадок центрифугата не попадают или обнаруживаются в незначительном количестве. Однако, в практической работе цитологам приходится сталкиваться с настоятельной необходимостью исследовать свернувшуюся жидкость. В этом случае образовавшийся сгусток необходимо извлечь. Для этого осторожно сливают не свернувшуюся жидкость, наклонив сосуд и придерживая сгусток палочкой. Затем сгусток вытряхивают в чашку Петри или какой-либо плоский сосуд. Тонкими острыми иглами нужно тщательно разволокнить свернувшуюся массу и отжать ее, скручивая на палочку, лучше деревянную. Выделившуюся жидкость центрифугировать и исследовать по общей схеме. Отжатый сгусток разложить на предметные стекла и тщательно размазать, а оставшиеся плотные нити и кусочки выбросить.

Цитологическое исследование выпотной жидкости включает следующие этапы:

  • описание макроскопического вида жидкости: количество, прозрачность, цвет, консистенция, наличие осадка и его плотность, наличие включений и взвеси.
  • центрифугирование:

ü 5-10 мин при 1500-3000 оборотах в минуту (если при центрифугировании  прозрачной серозной жидкости образуется незначительный осадок или он совсем не определяется, то целесообразно использовать метод концентрации клеток повторным центрифугированием, при этом на осадок наливают до 5-6 раз выпот и повторно центрифугируют);

ü лучшим способом обработки жидкости является центрифугирование в специальной цитоцентрифуге типа Cytospin, Rotofix и др.

Обработка жидкого биологического материала на цитоцетрифуге с функциями приготовления и окрашивания препаратов имеет следующие преимущества:

1. Методика обеспечивает стандартизацию преаналитического и аналитического этапов цитологического исследования.

2. В полученных препаратах клетки сконцентрированы на небольшой площади и равномерно распределены в виде монослоя, при этом полностью обеспечивается сохранность клеток и клеточных структур.

3. Значительно сокращается время на исследование препарата и его интерпретацию.

4. Для приготовления качественных препаратов достаточно небольшого количества жидкости – от 25 до 200 мкл.

5. Минимальные временные затраты на приготовление нескольких препаратов (до 25 мин) позволяют использовать метод в интраоперационной диагностике.

6. Полученные препараты можно использовать для иммуноцитохимического исследования как адекватной альтернативы иммуногистохимическому исследованию.

7. При злокачественной природе выпота расширена возможность установления гистологической формы и органной принадлежности опухоли. При доброкачественной природе выпота появляется возможность стандартизированного дифференцированного подсчета клеточных элементов для определения наличия или отсутствия воспалительного процесса, оценки его динамики. 

8. Метод повышает эффективность цитологического исследования выпотных жидкостей.

 

  • удаление надосадочной жидкости (супернатанта) отсасыванием при помощи специальной пипетки или обычной пастеровской пипеткой с надетой на нее грушей.
  • извлечение осадка из центрифужной пробирки:

ü небольшой однослойный рыхлый осадок встряхивается, и капля осадка наносится на предметное стекло;

ü осадок, имеющий 2-3 слоя, извлекается послойно путем отсасывания каждого слоя отдельно и переноса капель на разные стекла;

ü на дне большого кровянистого осадка могут присутствовать плотные тканевые фрагменты опухоли, поэтому после осторожного отсасывания и переноса на стекла основной массы осадка, необходимо перенести на стекло последнюю небольшую порцию со дна пробирки;

ü очень плотный осадок берется небольшими порциями на отдельные предметные стекла и распределяется на них ребром пункционной иглы, стеклянной палочкой или тонкой проволочной петлей;

ü мазки из студневидного осадка изготавливаются препаровальными иглами;

ü если в осадке обнаружены мелкие крошковидные массы или отдельные глыбки, их следует перенести на другое стекло и осторожно растянуть тонкими иглами.

  •  приготовление  препаратов из осадка для микроскопии:

ü необходимо использовать чистые, обезжиренные и сухие предметные стекла стандартного размера;

ü препараты для окрашивания из рыхлого осадка готовятся как мазки крови с обязательным образованием «метелочки, щеточки» за 1-1,5 см от края стекла;

ü мазок должен быть равномерным, монослойным, с хорошо просматриваемыми сохраненными  клетками и клеточными структурами;

ü плотный осадок аккуратно растягивается по стеклу острыми иглами максимально тонким слоем;

ü для всестороннего и полноценного исследования жидкости с учетом всего многообразия клеточных элементов и их структурных особенностей необходимо приготовить и просмотреть не менее 5 препаратов.

  • окрашивание препаратов:

ü окрашивание препаратов может производиться любыми красителями, которые используются в цитологической диагностике: азур-эозиновыми смесями, гематоксилин-эозином, по Папаниколау;

ü предпочтительнее использовать различные модификации метода Романовского (по Паппенгейму, Лейшману и др.), которые не требуют предварительной фиксации препарата (мазки, приготовленные для окрашивания, высушиваются на воздухе) и обеспечивают отчетливую окраску ядер с хорошо просматриваемой структурой хроматина.

Схема окрашивания мазков по методу Паппенгейма (модификация):

1. Высушить мазок на воздухе.

2. Опустить в фиксатор-краситель Мая-Грюнвальда на 5 мин.

3. Промыть водопроводной водой.

4. Стряхнуть избыток воды.

5.Докрасить азур-эозином: 2 части 0,1 % раствора азура, 1 часть 0,1 % раствора водорастворимого эозина и 3 части дистиллированной воды, рН 6,8-7,2. Смесь красителей готовится перед работой (ex tempore), окрашивание 5-10 мин.

6. Промыть водопроводной водой.

7. Высушить на воздухе.

ü  следует помнить, что время докрашивания определяется, как правило, эмпирически с учетом того, что жидкости окрашиваются значительно быстрее, чем материал соскобов или пунктатов, поэтому продолжительность докрашивания не должна превышать 10 мин.

         Эффективность цитологической диагностики по выпотным жидкостям во многом зависит от стандартизации всех преаналитических этапов: получения материала, сроков его доставки в лабораторию и условий хранения, способов приготовления и окраски цитологических препаратов, а так же от использования дополнительных методов исследования, таких как иммуноцитохимический и др.

Цитологический диагноз (заключение) может быть поставлен только по качественно приготовленным и окрашенным микропрепаратам с сохраненным клеточным составом.

         Рекомендуется ежегодное участие в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК) в цикле  «оценки качества приготовленных в лаборатории цитологических препаратов при доброкачественных и злокачественных патологических процессах» из жидкого биологического материала.

БИБЛИОГРАФИЯ

 

1. В. В. Долгов, И. П. Шабалова, И. И. Миронова, Т. В. Джангирова, А. Л. Коротаев. Выпотные жидкости. Лабораторное исследование.-М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006.-161 с.;436 ил.